Eletroforese Capilar no Seqüenciamento Automático de DNA

Para decifrar o código genético humano, os cientistas do Projeto Genoma tiveram de enfrentar a enorme tarefa de localizar as dezenas de milhares de genes que se encontram no DNA humano e em seguida fazer o seqüenciamento dos cerca de 3 bilhões de pares de bases contidas nos cromosomas. Com a tecnologia normalmente usada no início dos anos 90, essa tarefa levaria bem mais de 10 anos, com o custo de alguns bilhões de dólares. Foi o desenvolvimento da técnica de eletroforese capilar, combinada ao uso de radiação laser, que permitiu acelerar o processo, uma vez que essa técnica potencialmente é de 50 a 100 vezes mais rápida que o método tradicional.
A técnica tradicional para seqüenciamento de DNA é o método de Sanger, desenvolvida por Frederick Sanger, um dos ganhadores do prêmio Nobel de Química de 1980. Esse método utiliza enzimas especiais para sintetizar fragmentos de DNA que terminam quando uma determinada base (adenina, citosina, guanina ou timina) aparece ao longo da seqüência. (Para entender o básico) Esses fragmentos são, então, selecionados por tamanho, através da técnica de eletroforese: são colocados em uma lâmina de gel de poliacrilamida e submetidos a um campo elétrico. Devido à carga elétrica negativa da molécula de DNA, os fragmentos vão se movendo através do gel na direção do eletrodo positivo. Quanto menor o fragmento, mais rápido ele se move. Para serem identificados, os fragmentos carregam uma marcação radioativa.

Veja as diversas etapas de um seqüenciamento de DNA:
Um processo conhecido como clonagem de genes faz com que milhares de cópias do DNA em estudo sejam produzidas e uma marcação radioativa ou fluorescente é inserida em uma extremidade de uma das cadeias laterais.
Separa-se o DNA em quatro tubos de ensaio. A cada tubo se adiciona uma substância química que destrói uma das quatro bases e dessa forma pode quebrar a cadeia sempre que essa base aparecer. As reações são paralisadas antes que todos os possíveis pontos de quebra sejam desdobrados, produzindo fragmentos de diferentes tamanhos.
O DNA é removido de cada tubo e aplicado a uma camada de gel. Um campo elétrico é usado para fazer mover o DNA através do gel. Pedaços menores movem-se mais rapidamente que os pedaços maiores. Depois de certo tempo, a marcação radioativa ou fluorescente aparece como bandas distintas visíveis no gel. O padrão das bandas revela a ordem das bases na cadeia original do DNA.

Essa técnica é bastante sensível, permitindo distinguir um par de bases de outro par de bases. O problema é que os fragmentos de DNA levam horas para atravessar uma lâmina de gel. É aí que vem a vantagem da técnica de eletroforese capilar, desenvolvida principalmente pelos cientistas Richard Mathies e Xiaohua Huang. A eletroforese capilar associa o uso de tubos capilares cheios de gel a um sistema de varredura a laser e com isso faz o seqüenciamento de cada um dos diferentes tipos de base existentes em uma amostra de DNA: adenina, citosina, guanina e timina.
A eletroforese capilar reduz o tempo de migração dos framentos de DNA substituindo a lâmina de gel por centenas de pequenos capilares contendo gel. Esses capilares, de cerca de 100 micra de diâmetro interno, são reunidos em só feixe para detecção automática. Com isso, torna-se possível a aplicação de campos elétricos mais elevados para fazer com que os fragmentos se separem mais rapidamente. O uso de um sistema de detecção através de fluorescência confocal, excitada por laser, torna possível a análise de mais de um capilar de cada vez. Com a excitação e detecção confocal (uso de mesmos focos), em que a profundidade de campo do sistema ótico é suficientemente pequena para sondar apenas o interior de cada capilar, obtém-se alta resolução e eficiência de detecção.
Neste novo sistema, uma guarnição de capilares é colocada em um suporte e, sob controle computadorizado, cada capilar vai sendo submetido à varredura do feixe de laser. Os fragmentos de DNA, marcados com corantes de alta fluorescência, emitem fluorescência, que é filtrada e detectada por um fotomultiplicador.
Os trabalhos de Mathies e colaboradores, publicados no início da década de 1990, já relatavam a possibilidade de seqüenciar 10 mil pares de bases por hora.
A técnica de seqüenciamento "shotgun", utilizada, durante o seqüenciamento pioneiro do DNA humano, pela equipe de Craig Venter, da empresa Celera, é um método que usa enzimas para cortar o DNA em centenas ou milhares de pedaços aleatoriamente. Os aparelhos comuns de seqüenciamento automático, embora mais rápidos do que os antigos métodos "manuais", ainda decifram apenas fragmentos relativamente curtos de DNA, com cerca de 500 bases. Os cientistas, então, com auxílio do computador, têm que montar de novo os fragmentos seqüenciados, pedaço por pedaço, de modo que se assemelhe o máximo possível ao genoma original. O método "shot gun" se aplica a fragmentos de DNA clonados que já foram mapeados, cuja localização exata no genoma é conhecida, o que torna sua montagem mais fácil e menos sujeita a erros.