Además del efecto de la concentración del sustrato [ S ] en la rapidez de la reacción enzimática hay otros factores que afectan la actividad de las enzimas:
(a) La concentración de la enzima [ E ]: a mayor concentración de enzima mayor actividad catalítica (mayor velocidad inicial), siempre y cuando haya suficiente sustrato:
(b) El pH: todas la enzimas tienen un pH óptimo, al que habrá mayor actividad o eficiencia enzimática. Por lo general este valor fluctúa entre un pH de 6 a 8, aunque algunas funcionan mejor a bajo pH (pepsina). Los cambios en pH pueden cambiar las cargas electricas netas en los residuos de aminoácidos y alterar la estructura nativa.
(c) La temperatura: hay una temperatura óptima a la que habrá una mayor eficiencia enzimática. Por lo general, entre los 50° a 60°C la enzima pierde efectividad y la rapidez de la reacción disminuye bruscamente. A alta temperatura la enzima puede desnaturalizarse.
(d) Iones y coenzimas: sin la presencia de éstos, no hay actividad enzimática.
UNION DEL SUSTRATO CON LA ENZIMA
La enzima se une con una molécula del sustrato para formar un complejo enzima-sustrato (ES), que, a su vez, se disocia en el producto y la enzima, que se recupera:
El sustrato es, casi siempre, más pequeño que la enzima y se une a ésta en un lugar específico llamado sitio activo o foco activo. Típicamente, el sitio activo es una pequeña abertura o hendidura en la estructura tridimensional de la enzima.
Por lo general, la concentración del sustrato es mayor que la de la enzima, [ S ] > [ E ], por lo que los sitios activos se "llenan" rápidamente: la enzima se satura. En este punto, el producto se forma a cierta velocidad (Vmax), no importa si se aumenta la [ S ].
Caracteristicas particulares del sitio activo:
(a) Especificidad: una enzima puede discriminar entre diversas moléculas de posibles sustratos. De aquí el axioma "una enzima para cada sustrato". El sitio activo tiene una forma que se asemeja bastante al sustrato, por lo que sustrato correcto se "ajusta perfectamente" en el sitio activo.
Hay dos tipos de especificidad:
(b) Estructura: el sitio activo es una región tridimensional relativamente pequeña de la enzima. Cuando está totalmente encajado, el sustrato interacciona directamente con no más de 3 a 5 residuos de aminoácidos del sitio activo.
(c) Interacciones: los sustratos son retenidos inicialmente en el sitio activo por interacciones no covalente, débiles y reversibles, como la interacciones hidrofóbicas, los puentes de hidrógeno y los puentes salinos, que sostienen al sustrato orientado hacia los residuos de aminoácidos para una mayor eficacia enzimática. La siguiente figura ilustra la reacción enzimática (hidrólisis de un enlace péptido por una peptidasa) y la fijación del sustrato en el sitio activo:
El enlace escindido es el enlace que se va romper por la acción enzimática. Cuando el sustrato se une al sitio activo se crea una tensión en ese enlace, que se rompe parcialmente en el estado de transición. La energía necesaria surge de la energía liberada por la unión con el sustrato. El estado de transición se estabiliza por la interacciones no-covalentes que se forman.
MODELOS DE ESPECIFICIDAD
A-Modelo de Llave-Cerradura (Lock & Key), propuesto por Emil Fischer en 1890, establece que el sitio activo y el sustrato tienen estructuras complementarias. La forma y la distribución de cargas del sustrato le permiten "entrar" e interaccionar con el lugar activo de la enzima.
B-Modelo Ajuste Inducido (Induced-fit model), propuesto por Daniel Koshland en 1958. Las interacciones no-covalentes entre sustrato y enzima alteran la estructura tridimensional del sitio activo haciendo que éste se conforme al sustrato.
PROCESOS MECANISTICOS
Sustrato-Enzima: se mantienen unidos por interacciones no-covalentes débiles. En gran medida éstos son responsables de la velocidad de reacción. Una vez anclado al sustrato y estabilizado el estado de transición entra en juego otros procesos implicados en el mecanismo, como lo son, por ejemplo:
(a) Catálisis general ácido/base: grupos en las cadenas laterales del sitio activo pueden donar o aceptar H+. Los grupos funcionales del sitio activo de la enzima que se comportan como ácidos (-NH3+; -COOH) o como bases (-NH2; -COO-) y ayudan en las reacciones de transferencia de protones, facilitan la ruptura de enlaces. Por ejemplo, la hidrólisis ácida de un enlace péptido:
(b) Catálisis mediada por iones metálicos: los iones de los metales alcalinos (Na+, K+) y los iones de los metales de transición (Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+) ayudan en las reacciones anzimáticas de dos modos:
1-formando enlaces covalentes coordinados para fijar el sustrato y quede orientado apropiadamente y se una al sitio activo con una geometría muy específica:
2-polarizando el enlace que va a ser escindido o restabilizando el intermediario cargado negativamente:
3-participando en reacciones de oxidación-reducción mediante transferencia reversible de electrones entre iones metálicos y el sustrato:
Las metaloenzimas requieren del ion metálico para la actvidad enzimática.
(c) Catálisis covalente: grupos funcionales nucleofílicos (ricos en electrones) de una enzima reaccionan con el sustrato formando unh intermediario con enlaces covalentes inestables. El intermediario se degrada y se forma el producto.
Los siguientes aminoácidos contienen grupos nucleofílicos (circulados):
ALOSTERISMO Y COOPERATIVIDAD
Las interacciones entre las subunidades de una proteína multimérica se ven afectadas por la uniones con ligandos. En la alostería (o alosterismo), el control de la actividad proteína funciona por medio de la unión con ligandos: uniendo un ligando a un lugar específico en la proteína promueve un cambio conformacional que altera la afinidad de la proteína por otros ligandos. Esto se conoce como transición alostérica y los ligandos que promueven los cambios conformacionales son llamados efectores o moduladores . El término efector puede aplicarse a sustratos, activadores o inhibidores.
Los efectos alostéricos pueden ser positivos o negativos, dependiendo de si el efector aumenta o disminuye la afinidad proteínica por otros ligandos.
El cambio conformacional que ocurren en una determinada subunidad como respuesta a la unión de un ligando en un foco alostérico se conoce como efecto alostérico.
Con respecto a las enzimas, los efectos alostéricos se refieren a aquellos que se manifiestan en la actividad de una parte de la enzima - tal como el foco activo - por la unión de un efector en otra parte distinta de esa enzima.
Las enzimas alostéricas son usualmente multiméricas u oligoméricas (consisten de varias subunidades), por lo que contienen múltiples sitios activos. Subunidades idénticas se denominan protómeros, y cada protómero puede consistir de una o varias cadenas polipéptidas.
El concepto de cooperatividad se usa para explicar la interacción entre los lugares de unión con ligandos de estas enzimas; es la influencia que tiene la unión de un ligando a una subunidad sobre la unión de ligandos en otra subunidad de la proteína multimérica.
La cooperatividad generalmente implica cambios en la conformación debido al efecto de un ligando en una subunidad que, a su vez, promueve en otra subunidad adyacente un nuevo cambio conformacional, pero con una alterada afinidad por el ligando efector o por un segundo ligando.
El cambio conformacional puede ser inducido por un efector alostérico o por el sustrato. Ello implica que la unión entre el efector (la molécula que causa el efecto) y la enzima cambia la estructura de la proteína , lo que conlleva una "comunicación" a las otras subunidades de la proteína de que esa unión se ha producido.
La cooperatividad requiere de una proteína con varios focos activos, usualmente localizados en múltiples subunidades de una proteína multimérica. Las enzimas cooperativas son usualmente dímeros, trimeros, tetrameros, etc.
Ambos conceptos, alosterismo y cooperatividad, tienen aspectos comunes en lo que se refiere a los cambios estructurales requeridos por ambos. La esencia de los dos efectos está en que los eventos de unión y catálisis que ocurren en un foco activo pueden influenciar los eventos de unión y catálisis en otro foco activo de una proteína multimérica.
Un efecto alostérico puede ocurrir sin cooperatividad: cambios conformacionales inducidos en un protómero no se transmiten a otros protómeros.
Interacciones alostéricas homotrópicos son las que ocurren cuando varias moléculas idénticas - por ejemplo, varias moléculas del sustrato - se unen a la proteína. Este efecto se denomina como cooperatividad si el mismo se transmite a los diferentes protómeros de la proteína.
Los efectos alostéricos heterotrópicos son interacciones alostéricas que ocurren cuando diferentes sustancias - por ejemplo, inhibidor y sustrato - se unen a la proteína; son el efecto de un ligando en la unión de otro ligando diferente.
Los efectos alostéricos homotrópicos o heterotrópicos pueden ser positivos (activación) o negativos (inhibición):
-Si es positivo, entonces la unión del primer efector (activador) hace que sea más fácil la subsecuente unión del sustrato.
-Si es negativo, el primer efector (inhibidor), hace más difícil la subsiguiente unión del sustrato. (La cooperatividad homotrópica negativa es muy rara).
La acción enzimática alostérica se puede explicar por dos modelos que describen los cambios conformacionales en las subunidades individuales de una enzima multimérica. Estos son: modelo concertado y modelo secuencial.
Modelo concertado:
propuesto por Jacques Monod, Jeffries Wyman, y Jean-Pierre Changeux en 1965 para describir la cooperatividad:
La proteína (enzima) tiene dos conformaciones: la conformación T (tensa o taut) y la conformación R (relajada). En cualquier molécula enzimática, todas las subunidades están en la mismo estado conformacional (T o R). Sustratos y activadores se unen más facilmente a la conformación R ; los inhibidores son más afines a la T.
En ausencia de sustrato la enzima está más en el estado T que en el R. En el estado R todos los focos activos tienen una mayor afinidad para el sustrato que en el estado T. Una vez una subunidad cambia al estado R, todas las demás subunidades cambian simultaneamente al mismo estado.
Modelo secuencial:
propuesto por Koshland, Nemethy y Filmer, propone que la unión de un efector causa un cambio conformacional en una subunidad que, a su vez, promueve un cambio conformacional en las demás subunidades de forma secuencial.
Este modelo explica el cooperativismo negativo en el que en algunas enzimas la unión del primer efector reduce la afinidad de la enzima por ligandos similares.
REGULACION
A-Regulación Alostérica:
Las enzimas alostéricas llamadas enzimas reguladoras (o marcadoras del paso, "pacemaker"), determinan la rapidez de un proceso; estas enzimas catalizan el primer paso del proceso, o el primer paso de una ruta ramificada que lleva a la formación de un producto alterno. Son modificadas por la unión reversible no-covalente de una molécula señal; por ejemplo, para la secuencia:
La enzima reguladora responde a una cinética que no obedece a la ecuación de Michaelis-Menten porque no generan una hiperbola en la gráfica de velocidad inicial vs concentración de sustrato [S]. En su lugar, se obtiene una curva sigmoidal.
Este tipo de curva sugiere una relación de segundo orden (o mayor) entre la rapidez (velocidad) y [S], es decir v es proporcional a [S]n, donde n > 1.
A ciertos niveles de [ P ] el compuesto P puede actuar como inhibidor (efector negativo), proceso que se conoce como inhibición por retroalimentación negativa por ser un ejemplo de un efecto alostérico negativo en una enzima reguladora. Esta inhibición se observa cuando el producto final de una cadena inhibe la enzima del primer paso (u otro paso clave) de esa secuencia:
En este esquema, el producto "P" inhibe a la primera enzima (enz1) del proceso. Esto ocurre cuando se sintetiza suficiente cantidad de ese producto final. El compuesto "P" no tiene semejanza estructural con "A", el sustrato de la enz1, la enzima reguladora. De aqui que "P" debe unirse a la enz1 en lugar distinto del foco activo. Esto ilustra un efecto alostérico heterotrópico negativo ya que el producto "P" actúa como un efector negativo o inhibidor alostérico.
Complementando ambos procesos de regulación alostérica (efecto positivo y negativo) se producirá una cantidad adecuada de P sin que se agote por completo A.
B-Modificación Covalente:
Es la regulación de ciertas enzimas por la interconversión reversible entre su forma activa y desactiva. Esto ocurre primordialmente por la fosforilación y desfosforilación en residuos específicos de las cadenas laterales.
Este es un proceso enzimático: una enzima causa la modificación covalente de otra enzima (que actúa como sustrato). En algunos casos, la modificación transforma la enzima activa en la inactiva; en otros, es lo contrario. Por ejemplo:
C-Ruptura Proteolítica:
Proenzimas o cimógenos, son precursores enzimáticos inactivos. Estos pueden producirse y almacenarse y luego convertirse- irreversiblemente - en la enzima activa. El proceso implica la ruptura de uno o más enlaces péptidos (péptido bloqueador):
D-Regulación por Isoenzimas:
Algunos procesos metabólicos están regulados por isoenzimas (o isozimas), que son diferentes formas moleculares de una misma enzima. Estas tienen secuencias de aminoácidos similarers, pero no identicas. Todas catalizan la misma reacción bioquímica y tienen:
La más conocida es la lactato deshidrogenasa (LDH) que cataliza la conversión reversible de piruvato a lactato:
LDH es un tetrámero con dos posibles tipos de subunidades: M (muscular) y H (cardiaco). Hay 5 tipos diferentes isoenzimas:
LDH1 (H4); LDH2 (H3M), que se encuentran sólo en el corazón y en los glóbulos rojos
LDH5 (M4), que se encuentra en el hígado y músculo esqueletal
LDH3 (M3H); LDH4 (M2H2), que se encuentran en otros órganos.
La isoenzima M4 tiene mayor afinidad por piruvato y la H4 por lactato.
Es de esperarse que las varias formas estan diseñadas para servir a diferentes funciones regulatorias. Este tipo de regulación permite que diferentes patrones metabólicos funcionen en distintos órganos.