Le recenti scoperte sull’ingegnerizzazione degli anticorpi ed in particolare la
manipolazione dei geni che codificano per le immunoglobuline,
hanno reso possibile l’espressione dei domini responsabili del legame con l’antigene, in organismi eterologhi quali batteri (Skerra & Pluckthun 1988, Science, 240: 1038), lieviti
(Horwitz et al., 1988, P.N.A.S., 85: 8678) e piante(Hiatt et al., 1989, Nature: 342: 76). La possibilità di esprimere anticorpi specifici in piante transgeniche, rappresenta una
nuova e valida strategia per la difesa contro l’attacco di patogeni vegetali. Questa
strategia nota come "immunoterapia" genica delle piante, è stata adottata
con successo per la protezione contro le infezioni virali. Un frammento anticorpale a singola
catena (scFv-F8)
Anticorpo scFv F8
struttura di un frammento scFv
derivato da un anticorpo monoclonale specifico per il virus
vegetale AMCV (virus dell’arricciamento maculato del carciofo), e` stato espresso
in piante transgeniche di Nicotiana benthamiana, conferendo una significativa
protezione contro l’attacco virale(Tavladoraki et al.,1993, Nature:
366: 469). La principale limitazione di tale strategia e` rappresentata dalla scarsa
stabilita` e funzionalita` delle molecole anticorpali quando queste sono espresse
nel citoplasma. È in questo distretto cellulare infatti, che si svolgono
molte fasi del ciclo replicativo virale. Quindi, per una efficace immunoterapia nel citoplasma,
è necessario selezionare molecole dotate di particolari caratteristiche
di stabilità. Recenti studi condotti in vivo sulla molecola scFv-F8 hanno evidenziato
che essa viene espressa in forma solubile e funzionale nel citoplasma di cellule
vegetali (Tavladoraki et al., 1993) e di cellule di Escherichia coli (Tavladoraki et
al. in preparazione). Nella prima fase del lavoro sperimentale
è stata effettuata la purificazione mediante cromatografia di affinità,
dell’anticorpo scFv-F8 espresso in E.coli, al fine di poter studiare le caratteristiche
di stabilità dell’anticorpo impiegando tecniche di spettroscopia di fluorescenza. In una
fase successiva, è stata costruita, sulla base di un modello strutturale elaborato al
calcolatore, una nuova molecola scFv che fosse dotata della medesima stabilità
del scFv-F8 ma con una specificità antigenica diversa. A tale scopo sono stati sostituiti
alcuni residui amminoacidici delle sei anse ipervariabili dell’anticorpo scFv-F8,
responsabili del legame con l’antigene, con residui dell’ anticorpo modello D1,3
specifico per il lisozima (HEL- hen egg white lysozyme).
Anticorpo a sigola catena scFv D1,3
La costruzione di tale molecola ricombinante
è stata condottautilizzando
tecniche di mutagenesi sito-diretta. L’anticorpo cosi’ ottenuto,denominato scFv-F8MUT, è stato
espresso nel citoplasma di E.coli.
L’analisi dell’espressione mediante "Western
blot" ha dimostrato che la molecola e' presente in forma stabile e solubile
nel citoplasma ed ha indicato pertanto, che le sostituzioni amminoacidiche effettuate
non avevano alterato la stabilità strutturale della molecola. L’analisi della funzionalità
del scFv-F8MUT, mediante saggio ELISA, ha tuttavia mostrato l’assenza
di specificità antigenica per il lisozima,indicando che la mutagenesi effettuata
in base al modello elaborato al calcolatore, pur mantenendo le caratteristiche di
stabilità della molecola, non è stata tuttavia in grado di conferire nuova specificità
antigenica. Il primo obiettivo del lavoro sperimentale, dimostrare cioè
che è possibile modificare le regioni ipervariabili di un scFv mantenendo le caratteristiche
di stabilità della molecola, è stato raggiunto;mentre l’obiettivo di riuscire a variare
la specificità per l’antigene della nuova molecola scFv, non è stato raggiunto.
In un prossimo futuro si prevede una piu’estesa sostituzione di residui amminoacidici,
che dovrebbe permettere di raggiungere l’obiettivo prefissato:
la costruzione di una molecola scFv stabile e dotata di diversa specifità antigenica. La finalità è quella
di poter disporre di molecole anticorpali stabili e con la voluta specificità, da impiegare con
successo nella immunomodulazione di funzioni fisiologiche o patologiche che si svolgono nel citoplasma.
Per
visualizzare le molecole in 3D con Rasmol
Banca dati
Medline, per ricerche bibliografiche
Riviste
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