Clamidia pneumoniae:
 

Clamidia pneumoniae:

- Introducción:

  Clamidia pneumoniae (Cpn) es un parásito intracelular obligado patógeno para los humanos que causa neumonías atípicas, bronquitis, sinusitis, faringitis y exacerbación del asma. Además, está ha asociada a enfermedades coronarias, infecciones  sistémicas, síndromes neurológicos y renales. Es capaz de utilizar otros mamíferos e incluso amebas como células huésped a las cuales infecta. Recientemente, un grupo de investigadores ha encontrado C.pneumoniae en cerebros de 17 personas sobre un total de 19 que sufrían de la enfermedad de Alzheimer pudiendo tener C.pneumoniae cierta relación con esa enfermedad.
  Investigadores de la Universidad de Washington (EE.UU) fueron los primeros en identificar  Clamidia pneumoniae como un organismo patogénico distinto a C.trachomatis y C.psittaci, también fueron los primeros en desarrollar métodos de diagnóstico para la detección de la misma.
  Presenta algunas proteínas comunes al género Clamidia (MOMP, proteínas ricas en cisteína de 60 y 12 KDa, etc.) y otras específicas de esta especie (76 KDa, 65 KDa, 54 KDa, etc.). Estas últimas proteínas le brindan características estructurales que ayudan a mantener su  forma piriforme, e intervienen en procesos de adhesión e inmunogénicos propios de la especie, entre otros.
  Igualmente son susceptibles otros huéspedes tales como koalas y caballos. Últimamente ha sido posible la infección experimental de un parásito (la ameba Acanthamoeba castellanii).
  Se considera que esta especie de Clamidia produce infecciones desde muy temprana edad, presentando mayor incidencia en niños de 5 a 14 años. La mayoría de los adultos presenta evidencia serológica de infecciones pasadas.
 Su genoma ha sido recientemente secuenciado por completo. Está formado por un cromosoma circular que contiene 1.230.025 pares de bases con más de 1.069 genes potenciales.

- Características microbiológicas:

  Hasta 1989, se consideraba que todas las inclusiones de Clamidia que no correspondían a Clamidia trachomatis, eran Clamidia psittaci. Esto era así, debido a que tanto las inclusiones de C. pneumoniae como de C. psittaci no se fusionan, por lo que cada inclusión corresponde a una Clamidia; mientras que las inclusiones de C. trachomatis se fusionan y dan en general una sola inclusión por célula. Sin embargo existían otras diferencias, que hicieron suponer la existencia de otro microorganismo:

                 • Las inclusiones de Cpn no poseen glucógeno, mientras que las de C.trachomatis sí lo posee.
                 • El cuerpo elemental (CE) de C. pneumoniae es piriforme, mientras que el de C. psittaci es puntiforme.

  Por otra parte, posteriormente se descubrió que los CE´s de C. pneumoniae contienen una elevada cantidad de proteínas ricas en cisteína (CrP) que podrían ser responsables de mantener su forma característica.
  Por microfotografía electrónica se sugiere la existencia de un espacio periplásmico que no se ve en otras especies de Clamidias. Este espacio periplásmico es más denso en el CE que en el cuerpo reticular (CR).
 Otra característica distintiva es la ausencia de plásmidos en C. pneumoniae que sí están presentes en C. trachomatis y C. psittaci. Sólo se aisló un plásmido en la cepa  IOL-207 de C. pneumoniae.
 

- Epidemiología:

 La infección parece ser más común en chicos en edad escolar (5-14 años). Alrededor de los 20 años aproximadamente, el 50% de las personas tienen niveles detectables de Ac.
 Los chicos de entre 5 y 9 años tienen una alta incidencia de infecciones agudas, que disminuye en los de 10 a 14 años.
 La seroprevalencia en los menores de 15 años es igual para ambos sexos, pero en los adultos es considerablemente mayor en hombres que en mujeres.
 La transmisión parece ser persona a persona a través de secreciones respiratorias. La infección también se puede adquirir por medio de portadores asintomáticos.
 El período de incubación es de varias semanas, lo cual es mayor al de otros patógenos respiratorios.
 

- Estructura antigénica - Proteínas de membrana:

  Como es necesario que el CE sea internalizado por la célula huésped, se requiere la existencia de propiedades de superficie que favorezcan su entrada  a la célula que no es altamente fagocítica. Es posible que las proteínas ricas en cisteína (CrP)  sean las proteínas responsables de mantener la estructura del CE. En las bacterias esta función la cumple el peptidoglicano, pero en su ausencia, pueden ser las CrP las que lleven a cabo esta función.
  Los CR´s requieren energía de la célula huésped para crecer y dividirse; por ello  están asociados íntimamente a la membrana de la inclusión, quizás para captar nutrientes esenciales.
 

 MOMP:

  La proteína mayor de membrana externa es una de las proteínas rica en cisteína, codificada por el gen omp-1. Es una porina con un PM de unos 40 KDa (en Cpn el PM es de 39,5 KDa) y constituye el 60% de las proteínas de membrana externa. Es característica del género Clamidia, aunque presenta ligeras diferencias estructurales en cada una de las especies y también dentro de una misma especie. Cada MOMP cuenta con una estructura primaria única que resulta en distintas porciones de la molécula que son expuestas a la superficie del microorganismo; en consecuencia, diferencias en la MOMP, darán distintas serovariedades. No obstante, en C.pneumoniae la MOMP no parece estar expuesta a la superficie por lo que hasta ahora sólo se ha hallado una serovariedad. Esta teoría proviene de experiencias en las cuales se encontró que esta proteína no es inmunodominante, como en las otras especies de clamidias.
  Por su abundancia (60% de proteínas de membrana externa) y exposición superficial  (en C. trachomatis y C. psittaci) se le atribuye un rol muy importante tanto en la respuesta inmune del huésped a la infección por Clamidias, como en la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, en C. pneumoniae esto no sería posible debido a la pobre respuesta inmune que genera. A la MOMP se le ha asignado una función de porina, sin embargo, también se cree que cumple un rol electrostático en la adherencia y un rol antigénico (en C. pneumoniae la respuesta antigénica es débil).
 

 60 KDa:

  Es una proteína rica en cisteína codificada por el gen omp-2 (env B). Junto a la MOMP y a la proteína de 12 KDa, constituyen las proteínas mayoritarias en el complejo de membrana externa. Este complejo es similar al encontrado en las otras especies de Clamidia en cuanto a su estructura y PM. A pesar de pertenecer al complejo de membrana externa, la proteína de 60 KDa se encuentra en el espacio periplásmico, lo cual le otorga a la Clamidia una integridad estructural  equivalente a la del peptidoglicano. Al haber más espacio periplásmico en C. pneumoniae que en las otras Clamidias, se cree que hay más proteínas de 60 KDa, que ayudarían a mantener su forma característica.
  Esta proteína se encuentra altamente conservada entre las distintas especies de Clamidias (se usa un fragmento de su gen para técnicas de PCR), por esto se le ha asignado una función estructural en la formación de complejos unidos por -SS-. Sin embargo al existir diferencias entre ellas, se pueden identificar diferentes Clamidias. Se presenta con un 98% de homología intraespecie; 85% entre C.psittaci y C.pneumoniae; 100% entre las cepas Cal 10 y 6BC de C. psittaci y 100% entre las cepas IOL-207 y VR 1310 de C. pneumoniae (sólo se diferencian en 1 pb).
  Esta proteína es blanco del sistema inmune humoral en infecciones producidas por C.trachomatis  y C.pneumoniae, aunque los anticuerpos no son neutralizantes.
  Los CR´s son deficientes en la proteína de 60 KDa. Al tener solo la proteína de 12 KDa, es más frágil que el CE.
 

 12/15,5 KDa:

  Esta CrP es producto del gen omp-3 (env A). Es una lipoproteína hidrofílica. Algunos trabajos afirman que es una proteína que sufre glicosilaciones post- traslacionales, por lo cual le asignan distintos pesos moleculares.
  La deprivación de cisteína en el medio de crecimiento impide el pasaje de CE a CR.
  Las CrP de 60 y 12 KDa se expresan más tardíamente en el ciclo de crecimiento de la Clamidia. Se encuentran casi exclusivamente en los CEs.
 

 Hsp:

  Las proteínas de shock térmico (también denominadas proteínas de estrés o Heat Shock Protein) están relacionadas con la respuesta inmunopatológica e inmunoprotectora. Están presentes en C. trachomatis, C. psittaci y C. pneumoniae.
  Existen dos genes:

  • Gro El: Hsp 60. Está asociado con la respuesta hipersensible en infección crónica con C. trachomatis. Existe un 95-97% de homología entre C. trachomatis y C. psittaci. Está presente en C. pneumoniae, aunque no se encontraron datos respecto a su porcentaje de homología comparado con las otras Clamidias.

  • Dna K: Hsp 70. Neutraliza la infectividad, pero también se le asigna un papel en la adhesión. Existe un 87% de homología entre C. trachomatis y C. pneumoniae.
  En C. trachomatis tiene un rol en la adherencia, posiblemente actuando como adhesina o chaperona. Quizás también tenga actividad de ATPasa o de clatrina.
  En C. pneumoniae, posiblemente sea la proteína de 75 KDa.
 

 98 KDa:

  Es una CrP que se piensa que está sólo en C. pneumoniae. Se postula que puede proporcionar una estructura de membrana más rígida para sustentar la forma de pera, porque los entrecruzamientos de los puentes -SS- otorgan rigidez a la membrana externa.
 

 75 KDa:

  Usando la enzima de restricción Pst I, se obtuvo un fragmento de 4,2 Kb que codifica para una proteína inmunoreactiva. Estas proteínas (de 75 KDa) se identifican en lisados celulares de la cepa TWAR de C. pneumoniae y también en C. trachomatis y C. psittaci. La proteína encontrada en la cepa TWAR es común al género Clamidia, por lo cual se sospecha que tiene una importante función antigénica o biológica.
 

 76 KDa:

   Es una proteína específica de C. pneumoniae, diferente a la Hsp 70. Presenta inmunoreactividad.
 

 54 KDa:

  Es una proteína de superficie que fue aislada en 9 cepas de C.pneumoniae, mientras que no pudo hallarse  en la cepa Z432 de C.psittaci, ni en la cepa E de C.trachomatis. Se cree que es una proteína específica de C. pneumoniae, por lo que puede ser una útil herramienta de diagnóstico.
  Puede jugar un rol importante en la patogénesis de la infección por C. pneumoniae. Se estima que puede tener importancia como adhesina durante la adhesión. Algunos investigadores creen que está involucrada en procesos de ingestión de EBs por la célula huésped.
  Es el mayor inmunógeno durante la infección por C. pneumoniae. Es un potencial candidato para el desarrollo de vacunas  contra C.pneumoniae.
 

 65 KDa:

  Esta proteína se encontró sólo en C.pneumoniae. El gen omp-1 que codifica para la MOMP, se conserva en C.pneumoniae, por lo que sólo existiría un serovar (entre las cepas AR-39 y IOL-207 existe más del 99% de homología para el omp-1). Pese a ello, algunos investigadores hallaron más de un serovar en C. pneumoniae (distintos antígenos), que podrían producir distintas patologías. Se discute si cada serovar o cada genotipo son capaces o no de provocar distintas patologías (en las cepas TW- 183 y 2043 apareció una banda de 65 KDa, mientras que en las otras cepas estudiadas no apareció esta banda, sino una banda a 67 KDa). Estos datos sugieren que en C. pneumoniae las serovariedades no están dadas por la MOMP, sino por otra proteína con mayor exposición superficial de aproximadamente 65 KDa.
 

- Inmunología:

 La infección con C. pneumoniae induce la respuesta de IgG, IgA e IgM. Estos anticuerpos (Ac) se pueden testear por fluorescencia o por ELISA usando EB o inclusiones de células infectadas. Se pueden detectar Ac contra lipopolisacáridos (LPS) por fijación de complemento (FC), inmunoblotting o ELISA. También se desarrolla inmunidad mediada por células, demostrado por ensayos de transformación de linfocitos.

- Inducción de Persistencia:

 La persistencia en la infección por Clamidias implica la imposibilidad de obtener CE´s infecciosos. Estos CE´s se pueden obtener experimentalmente tratando cultivos celulares de C. trachomatis con penicilina, con lo que se obtienen CR´s aberrantes incapaces de replicarse. También puede conseguirse inhibiendo la multiplicación por el agregado de IFN-g o por ausencia de triptofano. Con esto se logra un aumento en la transcripción del gen Gro El, y una disminución en la síntesis de proteínas de membrana.
 Los cultivos se pueden infectar persistentemente con Clamidias cuando faltan los nutrientes esenciales para su multiplicación, tales como determinados aminoácidos (aa) o vitaminas, principalmente las del complejo B. Los aa se obtienen por síntesis de novo o a partir del pool que encuentra en la célula huésped. La deprivación de cisteína bloquea la conversión de CR en CE en C. trachomatis debido a que en los CE´s existen CrP que no se pueden sintetizar en los CR´s. En esta especie  la omisión de otros aa no inhibe la conversión de CR a CE. C. pneumoniae  requiere todos los aa excepto lisina. A pesar de ello, el crecimiento de C. pneumoniae en la línea celular HeLa aumenta cuando se produce depleción de los aa lisina y metionina.
 Después de un co-cultivo prolongado de C. pneumoniae y Acanthamoeba castellani in vitro,  se encuentran inclusiones aberrantes que sugieren condiciones sub-óptimas de crecimiento para C. pneumoniae; esto favorecería la persistencia de la infección.
 La infección persistente puede observarse también con después de un tratamiento con antimicrobianos. En el caso de C. pneumoniae, la persistencia es potencialmente importante porque esta Clamidia está asociada a enfermedades crónicas (arteriosclerosis, bronquitis crónica, asma) y si no se realizan tratamientos prolongados con antibióticos, puede generarse el fenómeno de persistencia. En experiencias en las que se trabajó con C. pneumoniae en dos concentraciones distintas y a las que se trató con doxiciclina (varias dosis durante 3 días) y azitromicina (una única dosis), se estableció que  luego de 14 días post- tratamiento no existían UFI/ml pero se detectó ADN de C. pneumoniae por PCR (77% cuando se trataba de inóculo de 107 UFI/ml y 25% cuando el inóculo fue de 106 UFI/ml).

- Manifestaciones clínicas

* Respiratorias:
 Las enfermedades más frecuentes asociadas a C. pneumoniae son neumonía y bronquitis, aunque también existen infecciones asintomáticas o no reconocidas. Muchas veces presenta faringitis al principio de la enfermedad.
 Puede actuar como un copatógeno o como un microorganismo oportunista cuando hay un daño concurrente o anterior del tracto respiratorio por otro microorganismo patogénico.
 Se aisló de pulmones de pacientes infectados con HIV y se detectó por PCR en especímenes de lavado bronco alveolar (BAL) de individuos inmunocomprometidos. Se ha sugerido que la infección con C. pneumoniae puede ser más común entre personas con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ya que en ellos se encuentran alta prevalencia de Ac.

* Infecciones sistémicas:
 Aunque no son comunes, se informó enfermedad febril en pacientes con neumonía, pericarditis, pleuritis y hepatoesplenomegalia. Se encontró por PCR en especímenes de biopsia, que se deposita en nódulos linfáticos e hígado.

* Ateromas:
 Hay evidencia de presencia de C. pneumoniae en placas ateromatosas. La evidencia morfológica y microbiológica se obtuvo por estudios de microscopía electrónica de ateromas de arterias coronarias, tinción inmunocitoquímica y PCR. El estudio se realizó sobre porciones de arterias coronarias de pacientes que recibieron un transplante cardíaco. Sólo se encontró C. pneumoniae en alta proporción en los pacientes que tenían ateromas (los pacientes estudiados no presentaban historia clínica de infección resiente del tracto respiratorio). No se encontró C. pneumoniae en muestras coronarias sin lesiones. A partir de estas observaciones se cree que C. pneumoniae puede contribuir a la patogénesis de la aterosclerosis por disminución o eliminación de la respuesta local. Los componentes celulares que son importantes para la patogénesis de la aterosclerosis incluyen células endoteliales, células de músculo liso y macrófagos. Estudios in vitro sugieren que C. pneumoniae es capaz de infectar y reproducirse en células de músculo liso de humanos, en células endoteliales de arterias coronarias y en macrófagos. Se sugiere también que la infección persistente con C. pneumoniae en arterias coronarias contribuye al desarrollo de aterosclerosis.  Es posible que ciertos factores de virulencia desconocidos o moléculas de adhesión de C. pneumoniae que favorecen la infección de las arterias coronarias puedan estar distribuidos geográficamente (se detectó en 20/38 casos en Seattle, pero sólo 1/50 en Brooklyn).

* Síndromes neurológicos:
 Las complicaciones neurológicas informadas no son comunes, pero incluyen meningoencefalitis seguida por infecciones del tracto respiratorio por C. pneumoniae, encefalitis, síndrome de Guillain Barré, meningo-radiculitis lumbosacral, meningitis aséptica y ataxia cerebelar. Estos casos subrayan el hecho que la infección por C. pneumoniae, así como la de C. psittaci, pueden presentarse con marcados rasgos neurológicos y causar neumonía severa. Por este motivo, se sugiere incluir la detección de clamidias en el diagnóstico diferencial de infecciones pulmonares con presentación neurológica.
 

- Diagnóstico:

* Aislamiento:
 Crece regularmente en cultivos y las inclusiones formadas son más pequeñas que las vistas con otras clamidias. Las células Mc Coy y HeLa 229 no son sensitivas (HeLa 229 es más sensible que las Mc Coy), mientras que las HL y Hep-2 son más sensibles.
 Las muestras se obtienen por hisopado de orofaringe y se recogen en medio de transporte (SPG) y se refrigeran a 4°C 1-4 horas debido a que se inactivan rápidamente a temperatura ambiente. Si el tiempo es mayor a 4 horas, se deben freezar a  - 65°C.

* Serología:
 Se usan MIF y FC. MIF evalúa la presencia de antígenos de EB específicos de C. pneumoniae. Distingue entre las fracciones IgG e IgM, con lo que se puede diferenciar entre una infección pasada y una reciente. La presencia de IgG indica una infección previa y se usa para detectar la prevalencia en la población. Los títulos de IgG aumentan significativamente a las 6-8 semanas post infección. La fracción IgM no aparece hasta tres semanas después de la aparición de los síntomas. Con FC se miden anticuerpos del género Chlamydia. En las reinfecciones muchas veces no se detectan Ac por FC y no hay respuesta de IgM.
 En poblaciones inmunocomprometidas, la hipogammaglobulinemia puede ser un factor limitante en el diagnóstico por detección de Ac.
 La detección de Ag por ELISA usando Ac género específicos presenta una sensibilidad regular (50% con respecto al cultivo).

* PCR:
 Se pueden amplificar secciones específicas que codifican para funciones desconocidas; secuencias de genes de rRNA 16S; secuencias para MOMP; o para una proteína de membrana externa CrP de 60 KDa. Para este tipo de método las muestras pueden obtenerse por hisopado nasofaríngeo, BAL, esputo o placas ateromatosas. Este parece ser el método más sensible para la determinación de Clamidia pneumoniae.
 

Referencias:

1. Campbell, L. A. y col. Isolation of a gene encoding a Chlamydia sp. Strain TWAR protein that is recognized during infection of humans. Infection and immunity; 1989, 57(1): 71-75.

2. Essig, A. y col. Infection of Acanthamoeba castellanii by Chlamydia pneumoniae. Appl. Env. Microb.; 1997, 63 (4): 1396-1399.

3. Gieffers, J. y col. In vitro susceptibilities of Chlamydia pneumoniae strains recovered from artheriosclerotic coronary arteries. Antimicrob. Agents and Chem.; 1998, 42(10): 2762-2764.

4. Grayton, J. T. y col. Current  knowledge on Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, an important  case of pneumonia and other acute respiratory diseases. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., March 1989, 8 (3): 191-202.

5. Harlan, D. y col.   Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteins.  Infection and immunity, 1982, 38 (3): 960-968.

6. Jantos, C. A. y col. Antigenic and molecular analyses of Different Chlamydia pneumoniae strains. J. Clinical Microbiology; 1997, 35 (3): 620-623.

7. Korman, T. y col. Neurological complications of chlamydial infections: case report and review. CID; 1997, 25 (10): 847-851.

8. Kuo, C. y col. Chlamydia pneumoniae (TWAR). Clin. Microb. Rev. 1995, 8 (4): 451-461.

9. Kuo, C. C. y col. Chlamydia pneumoniae (TWAR) in coronary arteries of young adults (15-34 years old). Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; 1995, 92 (7): 6991-6914.

10. Malinverni, R. y col. Effects of antibiotic regimens on course and persistence of expe-rimental Chlamydia pneumoniae TWAR pneumonitis. Antimicrobial agent and chem-otherapy; 1995, 39 (1): 45-49.

11. Moulder, J. Interaction of Chlamydiae and host cells in vitro. Microb. Rev. 1991, 55 (1): 143-190.

12. Mygind, P. Y col. Analysis of the humoral immune response to Chlamydia outer membrane protein 2. Clin. Diagn. Lab. Immunol.; 1998, 5 (3): 313-318.

13. Raulston, J. Chlamydial envelope components and pathogen-host cell interaction. Mol. Microb.; 1995, 15 (4): 607-616.

14. Watson, M. W. y col. The CrP operon of Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae. Microbiology; 1995, 141: 2489-2497.

15. Wiedmann-Al-Ahmad, M. y col. Reactions of policlonal and neutralizing anti-p54 monoclonal antibodies with an isolated, species-specific 54 KDa protein of Chlamydia pneumoniae. Clin. Diagn. Lab. Immunol.; 1997, 4 (6): 700-704.