- Condiciones de cultivo para C. pneumoniae:
 

  C. pneumoniae (Cpn) es un patógeno del tracto respiratorio principalmente;  aunque también se lo relacionó a enfermedades crónicas como la formación de placas de ateroma, infecciones sistémicas severas y síndromes neurológicos.
  El diagnóstico por cultivo es dificultoso porque no crece en las mismas condiciones que se emplean para el aislamiento de las otras especies de clamidias. Esto llevó a que se detecte su presencia por la búsqueda de anticuerpos específicos y mediante técnicas de biología molecular (PCR), que no requieren la viabilidad del microorganismo y por lo tanto se dificulten las investigaciones con respecto a sus características biológicas.
 

- Cultivo:

I) Líneas celulares empleadas:
 

  Los primeros trabajos de cultivo de Chlamydia pneumoniae (Cpn), hablan del uso de la línea celular HeLa229 para aislar este difícil microorganismo.1, 9 Debido al escaso desarrollo que se observaba en las líneas celulares utilizadas para las otras Clamidias, se empezaron a utilizar otras células, e incluso a realizar pre-tratamientos con el fin de mejorar el cultivo. Hasta aproximadamente 1992, un método muy usado, era el pre-tratamiento de las HeLa 229 con DEAE-dextrán. De esta manera, se logra una mayor penetración del microorganismo a la célula huésped.
 Sin embargo, Wong y col. y Mass y col. después, encontraron que las líneas H292 y HEp-2, son mucho más eficientes que la línea comunmente usada.11, 15 Las inclusiones en las líneas H 292 y HEp-2 son más grandes. Además, se evitaba el pre- tratamiento de las células, lo que disminuía el tiempo de infección de las células huésped: el tratamiento de HeLa229 con DEAE-dextrán antes de la infección incrementa la cantidad de inclusiones de algunas cepas de Cpn. No obstante, este efecto no se observó en H 292 ni en HEp-2.15
  Por otra parte, Roblin y col. trabajando con distintas líneas celulares con y sin tratamiento con DEAE-dextrán, demostraron que:
 
 

  Por lo tanto considera que la línea HEp-2 es la más sensible de las líneas celulares usadas, tanto para la propagación de Cpn de laboratorio como para muestras clínicas. Además, se evita el pre-tratamiento con DEAE-dextrán que produce un efecto adverso para la recuperación de Cpn (inclusiones muy pequeñas que son difíciles de ver).13
 

II) Medios de cultivo:

  Los medios de cultivo empleados son básicamente similares. Contienen medio base (MEM), buffer HEPES, SFB, antimi-crobianos (antibacterianos y antifúngicos), glucosa y cicloheximida. Difieren en las concentraciones de SFB (4-10%), así como también en el tipo y concentración de los distintos antimicrobianos.
 

III) Condiciones de infección:

a.  Tiempo: Se trabaja con monocapas celulares con 24 horas de incubación. Una vez producida la infección, se incuban entre 72 horas y 7 días. Wong y col. esta-blecieron el tiempo de incubación en 7 días para las líneas H 292, HEp-2 y HeLa229. Esto se debe a que las monocapas de estas células permanecieron intactas y viables en el medio de crecimiento de Clamidias, luego de la infección por Cpn por al menos 7-10 días a 36ºC. La cantidad de inclusiones se incrementó cuando se prolongó el período habitual de incubación. Cuando se usan concentraciones moderadas o bajas de inóculo, el incremento en las inclusiones es de 12 a 59 veces cuando se incuba durante 7 días.15

b.  Centrifugación: Las condiciones durante la centrifugación varían tanto en el tiempo, como en la velocidad y la temperatura. En algunos casos, también se realizan centrifugaciones adicionales a los 3-5 días post infección.14 De esta manera se consigue que los cuerpos elementales se liberen de las células e infecten a otras células, logrando mayor infectividad.
 

c.  Temperatura de crecimiento: La temperatura de incubación varía entre 35ºC y 37ºC. La formación de inclusiones en HeLa229 es mayor a 35ºC que a 37ºC. 9 Para las otras líneas celulares no se hicieron estudios comparativos entre las temperaturas de incubación, pero se prefiere trabajar a 37ºC.
 

IV) Otros tratamientos:

a.  EDTA o tripsina: Kazuyama y col. ensayaron tratamientos previos de las monocapas celulares con EDTA y tripsina en distintas concentraciones con el fin de favorecer la recuperación de Cpn para estudios posteriores.  En este caso, se sustituyó el tratamiento previo de HL con DEAE-dextrán por tratamientos con tripsina o EDTA. Se encontró que el uso de tripsina 0,1% o EDTA 1mM durante 20-30 minutos a 37ºC previos a la infección aumenta la efectividad de adsorción de los cuerpos elementales y por lo tanto, éstos son más rápidamente fagocitados por la célula huésped. El mecanismo por el cual se produce este fenómeno no se conoce, pero la desagregación de los grupos de partículas de cuerpos elementales  y/o cuerpos de inclusión por tripsina, EDTA, o sonicación no es probable. El tratamiento con tripsina o EDTA no sólo reforzó la actividad de formación de inclusiones sino también el desarrollo de cuerpos de la inclusión múltiples grandes en las células.8

b.  PEG: El polietilénglicol (PEG) es una molécula de alto peso molecular que disminuye la constante dieléctrica y por lo tanto aumenta la hidrofobicidad de las membranas, lo cuál facilita la fusión de estas estructuras celulares. El tratamiento con PEG  fue utilizado para aumentar el aislamiento de C. trachomatis.  Tjhie y col. investigaron si el tratamiento con PEG, el aumento en el tiempo de incubación y centrifugaciones adicionales podían mejorar el crecimiento de Cpn en las monocapas celulares. Sus conclusiones fueron que altos porcentajes de PEG son tóxicos para la célula, pero el pre-tratamiento con PEG 7% en Optimem no influyó sobre la viabilidad celular y aumenta la recuperación de Cpn. El incremento en el número de UFI vistos después de una incubación prolongada se debe probablemente a la infección de nuevas HEp-2 por cuerpos elementales liberados después del primer ciclo de multiplicación. 14
 

- Conclusiones:

  En los trabajos en los cuales se utilizan muestras clínicas, la bibliografía recomendada es aquella en las que se usan las líneas celulares Hep-2, H292 y HL. Estas líneas resultaron ser más eficientes tanto para el trabajo con cepas de laboratorio como para el diagnóstico en muestras clínicas. En cuánto a las condiciones para infección, se observó que el tiempo y la velocidad de centrifugación pueden variar, pero no se establecieron condiciones más favorables que otras. Se acepta que los pasajes múltiples mejoran la sensibilidad de cultivo para Cpn; por otra parte, debería favorecerse la infección cuando se realizan más de una centrifugación (el mismo día o a los 3 días post-infección).
 También se recomienda una incubación de 7 días, si las monocapas celulares permanecen intactas y viables, además la prolongación en el tiempo de incubación permite el desarrollo de inclusiones más grandes que facilitan la visualización microscópica.
 Los distintos tratamientos previos de las monocapas celulares favorecen la infectividad de las Clamidias, y posiblemente también contribuyan a disminuir el tiempo y/o velocidad de las centrifugaciones adicionales.
 En el caso de muestras clínicas, se recomienda preparar 3 viales: uno se revela a los 3 días; si es negativo, se revela otro a los 7 días; en caso de dar positivo, se utiliza el tercero para el  aislamiento y estudio del nuevo microorganismo.
 

- Referencias:

  1) Campbell, Barnes, Kozarsky, Spika. 1991. Culture-confirmed pneumonia due to Chlamydia pneumoniae. J Infect Dis 164: 411-413.

  2) Gaydos, Roblin, Hammerschlag, Hyman, Eiden, Schachter, Quinn. 1994. Diagnosis utility of PCR-Enzime immunoassay, culture, and serology for detection of Chlamydia pneumoniae in symptomatic and asymptomatic patients. J Clin Microbiol 32 (4): 903-905.

  3) Gaydos, Summersgill, Sahney, Ramirez, Quinn. 1996. Replication of Chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages, endothelial cells, and aortic artery smooth muscle cells. Infect Immun 64(5): 1614-1620.

  4) Gibson, Egerer, Wiedbrauk.. 1993. Improved isolation of Chlamydia trachomatis from a low-prevalence population by using polyethylene glycol. J Clin Microbiol 31 (2): 292-295.

  5) Gieffers, Solbach, Maass. 1998. In vitro susceptibilities of Chlamydia pneumoniae strain recovered from atherosclerotic coronary arteries. Antim. Agents Chem 42(10): 2762-2764.

 6) Godzik, O´Brien, Wang, Kuo. 1995. In vitro susceptibility of human vascular wall cells to infection with Chlamydia pneumoniae. J Clin Microbiol 33(9):2411-2414.

 7) Kazuyama, Lee, Amamiya, Taguchi. 1997. A novel method for isolation of Chlamydia pneumoniae by treatment with trypsin or EDTA.J Clin Microbiol 35(6): 1624-1626.

  8) Korman, Turnidge, Grayson. 1997. Neurological complications of chlamydial infections: case report and review. Clin Infect Dis 25: 847-851.

  9) Kuo, Grayston. 1988. Factors affecting viability and growth in HeLa229 cells of Chlamydia sp. strain TWAR. J Clin Microbiol 26 (5): 812-815.

10) Kuo, Jackson, Campbell, Grayston. 1995. Chlamydia pneumoniae (TWAR). Clin Microbiol 8(4): 451-461.

11) Maass, Harig. 1995. Evaluation of culture conditions use for isolation of Chlamydia pneumoniae. Am J Clin Pathol 103(2): 141-148.

12) Ramirez, and the Chlamydia pneumoniae/ Atherosclerosis Study Group. 1996. Isolation of Chlamydia pneumoniae from the coronary artery of a patient with coronary atherosclerosis. Ann Intern Med 125: 979-982.

13) Roblin, Dumornay, Hammerschalg. 1992. Use of HEp-2 cells for improved isolation and passage of Chlamydia pneumoniae. J Clin Microbiol 30(8): 1968-1971.

14) Tjhie, Roosendaal, Mac Laren, Vandenbroucke-Grauls. 1997. Improvent of growth of Chlamydia pneumoniae on HEp-2 cells by pretreatment with polyethylene glycol in combination with additional centrifugation and extension of culture time. J Clin Microbiol 35(7): 1883-1884.

15) Wong, Skelton, Chan. 1992. Efficient culture of Chlamydia pneumoniae with cell lines derivated from the human respiratory tract. J Clin Microbiol 30 (7): 1625-1630.