- Genotipificación de especies de Clamidias por análisis de restricción del gen Omp-1:

  C. trachomatis se la clasifica en 18 serotipos: A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I; Ia, J, K, L1, L2, L2a y L3. Esta clasificación está basada en el análisis de la proteína principal de membrana externa (MOMP), antígeno clamidial primario en la serotipificación, con anticuerpos monoclonales y policlonales. La MOMP contiene cuatro dominios variables (DVs) que son flanqueados e interespaceados por cinco dominios constantes. Tres de los cuatro DV (DV1, DV2 y DV4) están expuestos en la superficie y contienen epitopes antigénicos que van a ser los blancos para la serotipificación.
  La necesidad de múltiples pasajes celulares y un gran número de anticuerpos monoclonales es el gran inconveniente en la serotipificación de la MOMP por lo que el análisis por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) del previamente amplificado gen Omp-1, que codifica para la MOMP, es simple, rápido y una poderosa herramienta en estudios epidemiológicos. Este método permite la diferenciación de no solo todos los serotipos y serovariantes, sino también de genovariantes. Por lo tanto, el objetivo del futuro estudio será el desarrollo de una PCR realizada sobre muestras de distintos orígenes para la determinación y posterior genotipificación de  Clamidias.
  Lo primero que se hace es la amplificación del gen omp-1 mediante la técnica de PCR (reacción de la cadena de la polimerasa). Luego se procede a digerir el producto obtenido mediante enzimas de restricción. Para cada tipo de Clamidia se obtendrá un patrón de bandas características al realizar la corrida electroforética.
  A continuación se muestra un protocolo de trabajo típico que se lleva a cabo en nuestro laboratorio:

- Materiales y Métodos:

     Muestras de Clamidias: cepas de Clamidias propias y muestras de distintos orígenes.

     Tratamiento de las muestras: simple hervor de las muestras durante diez minutos o transferencia de las muestras a eppendorfs de 1,5ml y se lleva a volumen con PBS estéril. Centrifugación a 13000 RPM, 4°C, 1h 30 en microcentrifuga. Remoción del sobrenadante. Se agrega 130ml de buffer de lisis ( Tris-HCl: pH8 10mM, MgCl2 2,5 mM, KCl 50 mM, Tween 20  0,5% ) por tubo: 125ml de buffer más 5ml de proteinasa K. Se vortexéa para homogeneizar los pellets. Incubación a 55-60°C, 1h en un baño termostatizado, luego a 100°C, 10 min. para desnaturalizar la proteinasa K. Los lisados se mantienen a -20°C o se usan directamente para la amplificación.

     Amplificación del gen Omp-1 ( PCR ): se colocan por tubo 32ml H2O, 5ml de buffer 10X, 1ml de dNTP 10mM, 1,5ml de cada primer, 2ml de MgCl2 ( 25mM ), 0,4ml de taq polimerasa ( 5U/ml ) y 2ml de dimetil sulfóxido. Luego se colocan 10ml de muestra para la amplificación. Se usan los primer SERO 1A ( sense 5'-atgaaaaaactcttgaaatcgg- 3' ) y SERO 2A ( antisense 5'-tttctagat/cttcatt/cttgtt- 3' ). Los productos de PCR ( 10ml de cada uno ) se analizan por electroforesis en gel de agarosa 1,5%. Condiciones de migración: 40mV, 1h, en buffer TBE 0,5X. Después de la migración se observa el gel en un transluminador de UV previa tinción del mismo con bromuro de etidio.

       RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ): por muestra de ADN se coloca 2ml de buffer 10X ( buffer TBE 10X: Tris 162gr., ácido bórico 50gr., EDTA Na2.2H2O  9,5gr., H2O csp ), 12,5 ml H2O y 0,5 ml de enzima Alu I. Luego se agrega 5ml de producto de PCR y se incuba 1,30 horas a 37°C. Se centrifuga el tubo rápidamente y se agrega 3ml de Blue al mismo. Luego se dispone 22ml del digerido en un well de un gel de poliacrilamida al 12%. Condiciones de migración: 10mA para 1 gel, 20mA para 2 geles, 3h, en TBE 1X. Al terminar la migración, se tiñe el gel con bromuro de etidio por 10 minutos. Se observa el mismo en un transluminador de UV.