Complejo de Iniciación de la Transcripción

Roberto Viau

Los eucariotes tienen tres tipos de ARN polimerasas, una para cada tipo de genes. De todas estas, la más entendida es la polimerasa II. Los genes de tipo II contienen varias secuencias de consenso. Estas pueden promotores basales, elementos proximales al promotor, o estimulantes distales. ⁱⁱⁱ Una secuencia del primer tipo es TATA. Se encuentra 25 pares de base arriba del sitio de inicio. Además hay un sitio Inr que se encuentra inmediatamente antes del sitio de inicio. Antes de iniciar la transcripción es necesario que se arme un complejo con los factores generales TFIIA, B, D, E F y H. Este complejo viene siendo el equivalente al factor de E. coli. ^Iii

TFIID es un factor general de transcripción compuesto por un TBP (TATA binding protein), y TAF's (proteínas asociadas al TBP).ⁱ Son las TAF's las que proveen la especificad para las variaciones entre células y entre especies.ⁱⁱ Este factor es el blanco de muchos sistemas de regulación de la transcripción. Está encargado de reclutar a la ARN polimerasa para que esta inicie la transcripción. ⁱⁱⁱ

La unidad del TFIID necesaria para la unión al ADN es la TBP. ^iv Esta es una proteína con dominios de unión altamente conservados. Esta estructura tiene dos características muy importantes. Primero, se parece a una silla de montar, que es "cabalgada" por el ADN. Esto lo logra mediante 8 láminas Beta antiparalelas. ^{iii, iv} Es interesante que la unión se hace en la hendidura menor del ADN, contrario a lo que hacen la mayor parte de proteínas que se unen a la hendidura mayor.

La segunda característica es la presencia de dos dominios topológicamente idénticos, pero que difieren en un 70% en secuencia de amino ácidos. ^{ii, iv} Esto permite que TBP pueda actuar asimétricamente con el ADN. Esto le permite reconocer secuencias no palíndromos de TATA, y proveer de direccionalidad a la síntesis de ARN. Además, la TBP tiene al final de cada dominio unos segmentos con unos residuos de Phe, que se sabe, son cruciales para enlazarse con el ADN. ⁱⁱ Sin embargo, la geometría de esto no es tan simple como parece. El eje largo de la silla de montar no está en un ángulo recto con el eje del ADN, sino más bien paralelo a él.

Se puede visualizar a la TBP como un arco. El ADN se une en esta concavidad, y la sigue con casi la misma concavidad de la proteína. ⁱⁱ Resulta entonces que la adhesión de TBP al elemento TATA hace que el ADN se doble en 80º. La torsión es compensada desenrollando la hebra 110º. Es de notar que a pesar de esto, se mantienen las interacciones de hidrógeno Watson-Crick. ⁱⁱⁱ Esto ocasiona que la hendidura menor se aplane e interactúe con la parte interior de la TBP, mediante un gran número de interacciones hidrofílicas e hidrófobas. La curvatura en el ADN se produce en las 7 posiciones (recordar secuencia TATA: TATAt/aAt/aA), pero es más fuerte en las posiciones 1 y 7, debido a los residuos de Phe ya mencionados. ⁱⁱ

Las consecuencias de esto podrían incluir acercar otros factores de iniciación al complejo de iniciación e iniciar la ruptura del ADN en el sitio indicado. ⁱⁱ

Con respecto a la direccionalidad, el extremo 5' del ADN siempre se enlaza con el extremo carbono terminal de la TBP, y el 3' con el amino terminal. Esto se puede explicar en parte por la asimetría de TBP, pero también es posible que el ADN participe activamente. Sus mismas propiedades físicas podrían incluir información relevante a la polaridad. ⁱⁱ

Hasta el momento sólo se ha mencionado la importancia de la parte cóncava de la TBP, sin embargo la parte convexa también es muy importante. En esta ocurre interacciones con un gran número de proteínas. Estas incluyen TAF's, otros factores generales de iniciación, y proteínas activadores o represoras upstream. ^{i, iv}

Entre los otros factores generales de transcripción que se enlazan a TBP está TFIIA y TFIIB. El primero se que se enlaza en un punto definido de la parte superior de TBP y tiene que ver con la estabilidad del TFIID .^x, En cuanto a TFIIB se conoce el sitio de interacción específico, y se sabe es necesario para el reclutamiento de una ARN polimerasa. ^{iv, v} TFIIB consiste de un región amino terminal con una supuesta área de enlace a un ión metal (probablemente zinc). Esta región está conectada a un núcleo carboxilo terminal (IIBc) resistente a proteasas. Esta región se puede unir al complejo TBP-ADN, pero no puede reclutar una ADN polimerasa.

Cuando el TFIIB se une a TBP se produce un importante cambio conformacional en IIBc. El cambio es tan importante que podría ser un paso limitante y regulatorio para la formación del complejo de iniciación. TFIIB no sólo interactúa con TBP, sino que también con el ADN. El TFIIB se une debajo y en una cara del complejo de TBP-ADN, donde se engancha a los extremos carboxilo terminal ricos en Phe de TBP. Todos los contactos de TFIIB y ADN son con el esqueleto de azúcar y fosfato, lo que indica que es independiente de la secuencia. La adherencia de TFIIB a TBP es asimétrica, ya que no es la misma para cada uno de las cadenas carboxilo terminales. Este factor sólo se une a un complejo de ADN ya deformado por TBP, por lo que no se puede unir a sitios distintos a TATA (o donde actúe TBP). ^v

La otra función del TFIIB consiste en reclutar a la ARN polimerasa ya unida al TFIIF. Esto lo hace en su región amino terminal ,donde tiene unido el zinc. ^vi. También se sabe que TFIIB está implicado en la regulación por medio de activadores ácidos. Esto lo hace por interacción directa con ellos o mediada por TBP. Generalmente se dice que los activadores ácidos facilitan la adhesión de TBP-TFIIB a los promotores, sin embargo, es más probable que mejoren la interacción de la polimerasa con TBP-TFIIB. Esto se sospecha ya que TBP y TFIIB se unen con una afinidad más o menos buena al promotor, pero en ausencia de activadores puede ser muy poco efectiva, y sólo realiza la transcripción basal.

El complejo TBP-TFIIB-ARN poli-TFIIF-ADN no es suficiente para iniciar la transcripción. El TFIIH juega un papel muy importante en esto. Como se mencionó al inicio, TBP ayuda de cierta forma a desenrollar la hebra de ADN, pero lo hace guardando las interacciones Watson – Crick. TFIIH se sabe tiene una actividad de ATPasa.^vii Parte de esta actividad se justifica por su función de kinasa, de la que se discutirá más adelante. Resulta que la subunidad más grande de TFIIH es ERCC3, una proteína de reparación de ADN. Esta proteína, a su vez contiene un dominio de helicasa dependiente de ATP. (por lo tanto, TFIIH puede actuar como una reparadora de ADN por excisión de bases....) Esta función de helicasa actúa al inicio de la transcripción, abriendo el complejo. La reacción no es dependiente de ATP, sino de cualquier NTP. Una vez actúa esta helicasa se pasa a la fase de enlongación, en la que ya no es requerida. Sin embargo, la acción de helicasa de TFIIH no siempre es necesaria in vitro (lo es in vivo), ya que si el ADN está más enrollado de la cuenta, la energía para romper los enlaces proviene de la misma tensión del ADN. Una vez el ADN está abierto, (promoter clearance), la hebra de ADN se sigue desenrollando, por un mecanismo todavía desconocido.

Antes de llegar a la fase de enlongación es necesaria la fosforilación de la cadena carboxilo terminal (CTD) de la ARN polimerasa. Esto lo hace TFIIH también. ^viii A la hora de reclutar la ADN polimerasa, se recluta una forma no fosforilada de ella, sin embargo, en complejos que están funcionando sólo se encuentra la forma fosforilada. La cola CTD contiene 52 repeticiones de amino ácidos, y se conocen muchas kinasas que los podrían fosforilar. Sin embargo, al eliminar todos estos candidatos, aún se fosforila, lo que lleva a pensar en que es un factor de iniciación el encargado de eso. TFIIH es un buen candidato ya que es mantenida en detención mientras se forma el complejo de iniciación, y una vez este formado, aumenta su actividad de kinasa. De todas maneras, es posible que no sólo TFIIH fosforile al CTD. Además se necesitan otros factores a parte de TFIIH: TFIIE y TFIIJ. Su función se desconoce. Una vez fosforilado el CTD y la helicasa actuando, se desprende la polimerasa, dejando al TFIID en su sitio, listo para iniciar otro complejo de iniciación.

Como se mencionó, una vez se forma un complejo de iniciación, TFIID permanece unido al promotor. Esto permite que una vez ser arme el complejo se pueda producir rápidamente una gran cantidad de ARN, y por tanto de proteína. Todo esto tiene que ver con la remodelación de la cromatina. En un ADN empacada entre histonas, no es posible que se forme el complejo, ya que TBP no puede unirse a TATA. Sin embargo, una vez se logra esto, ya no es posible empacar el ADN en ese punto, dejando ese gen activo para la transcripción. ^iii, Se supone que esto es debido a la deformación del ADN por parte de la TBP.

Hasta el momento sólo se han considerado el complejo de iniciación para genes tipo II. En un principio se pensó que los factores que actuaban en cada ARN polimerasa eran distintos para cada tipo de gen. ^ix Sin embargo, se ha podido comprobar que el mecanismo general viene siendo el mismo, con muchas proteínas idénticas, incluso la TBP. Es de notar que muchos de estos genes no tienen una secuencia TATA, sin embargo, mediante la ayuda de otras proteínas la TBP logra cumplir su papel. Se ha encontrado actividad de TBP en genes tipo III, y ahora se sabe que el compelejo SL1 de los genes tipo I es el equivalente del TFIID, y contiene una TBP. Este, además contiene tres TAF's. La diferencia en la transcripción de los genes viene siendo entonces que TAF's se asocian a TBP. ^ix,

Por otra parte, se ha creído que cada factor de transcripción tiene una función única. Esto también ha sido desacreditado, ya que aparentemente hay varios posibles sustitutos de TFIIA. Incluso, se cree que puede no ser necesario este factor para la transcripción basal. ^ix,

Finalmente, se creía que todos los factores eran indispensables para todos los genes. Esto ya no se cree así, ya que TFIIE parece no ser siempre necesario. Sin embargo, al desconocer la función de este factor, podría ser que se requiera, sólo que en cantidades difíciles de detectar. ^ix,

Aunque no son factores generales, los TAF's se creían también indispensables para la transcripción. Esto se concluyó debido a la necesidad de TAF's in vitro. Sin embargo ,en experimentos in vivo se modificaron los genes de TAF's de tal forma de volverlos no funcionales. Se produjo la muerte celular, pero muchos complejos de transcripción permanecieron activos. Esto lleva a hablar de la holoenzima de ARN polimerasa. Esta está constituida por una colección de factores generales de transcripción y un complejo con muchas proteínas reguladoras, entre ellas las Srbs. Si se purifica la holoenzima, se logra transcripción in vitro, aun en la ausencia de TAF's. ^ix, Notes contradicción: Carey considera que los Srbs son TAF's, además Young y Chao dicen que los TAF's son los que permite a la TBP de actuar con otros genes diferentes a los del tipo II.

Los TAF's podrían entonces participar en la expresión de sólo algunos genes esenciales, probablemente los relacionados al ciclo celular. En eucariotes inferiores es de esperar muy pocos genes que requieran TAF's, pero conforme se complica la diferenciación celular, es probable que una mayor proporción de genes requieran estos factores.

Ya se mencionó que la holoenzima de la ARN polimerasa está formada por diversos factores. Todo esto lleva a la simplificación de lo anterior. Con más exactitud la holoenzima está formada por TFIIB, TFIIF y TFIIH, junto con los Srbs. ^x La ventaja de este modelo es que permite pensar que los reguladores actúan y reconocen a la holoenzima en vez de interactuar de una forma compleja con sus componentes. Sería de esperar que TFIIA se encontrara en la holoenzima, sin embargo, es posible que esta funcione sin su presencia. Esto se debe a que TFIIA sólo está involucrada en la estabilidad de TFIID y compite con inhibidores que impiden la formación del complejo al unirse a TFIID. ^x,